优化ELISA实验的重点之一在于洗涤。洗涤步骤可降低未结合抗体所引起的背景信号，从而增加分析的信噪比。每一步之间的洗涤确保只有特异的结合事件被保留，在最后一步产生信号。而不充分的洗涤会导致差异和高背景，从而带来不理想的结果。影响洗涤的效果主要有以下几个因素：
一、 洗涤量
一些参数会影响洗涤的效果。第一个主要的参数是洗涤量。自动洗板机会分配洗涤液。如果之前遭遇过高背景，就要将洗涤量调高，最好是比包被体积更高。太少的洗涤液会让一部分分析表面洗涤不到，从而明显增加背景。所有反应孔的洗涤量必须相同。ELISA板通常会在试剂盒的使用手册中列出包被量。一般来说，洗涤量越高，则孵育步骤残留的抗体或抗原量就越少。
二、洗涤次数
第二个影响洗涤效果的主要参数是洗涤循环的量。当然，洗涤次数越多，背景越低。然而，太多次的洗涤会降低信号强度，使其难以测定。通常的做法是在每次抗体或抗原孵育后重复洗涤三次。
控制洗涤量和洗涤次数的另一种方法是加入过量的洗涤液。一般来说，96孔板的每个孔能容纳330至460μl。不过，有些自动化洗板机可设置程序，分配远远超出这个量的洗涤液，就是在分液的同时打开吸液功能。换句话说，随着分液器分配更多的液体，抽吸器也将液体吸出。这种技术能增加洗涤量，但不会溢出到其他孔中。
三、抽吸
另外，还有一些参数会影响洗涤的效果。这些参数包括吸液高度和吸入位置，这两者都能调整，以降低背景（残留量）和差异。
残留液体中包含未结合的抗原或抗体，它们会增加背景信号。残留量越小，残留液体越少，转移到下一步的干扰液体也就越少。吸液高度会明显影响残留量。如果洗涤吸头与反应孔底部的距离稍大，那就会让残留量急剧增加。反之，如果洗涤吸头压着反应孔底部，那么也会使吸液效率降低，残留量增加。
抽吸的位置也对残留量有着重要影响。如果每个孔只使用一个抽吸点，那么抽吸的位置需要优化。最佳的位置取决于洗头的性状，但它几乎不在反应孔的中间，即使这是所有洗头最常见的默认位置。一般来说，最佳位置在孔中间与孔壁之间的某处。
洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。应引起高度重视，严格按要求洗涤，不得马虎。
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