温育是ELISA测定中影响测定胜败最为要害的一个要素。也是最容易出现问题的一个过程。通常目前国内ELISA产品试剂盒的反应温育时间为37 ℃ 30分钟～1小时，进口ELISA试剂盒则通常为37 ℃ 1～2小时才会有较完全的结合，低于1小时，或许会影响测定下限。因此，关于温育，在实践测定操作中必定要留意以下几点：
（1）要保证在设定的温度下有满意的反应时间。一般来说，加完样本或反应试剂后，将微孔板从室温拿至水浴箱或温箱中时，孔内温度从室温升至37℃，需求必定的时间，尤其是在室温比较低以及非水浴的状态下，这段升温时间或许还比较长，然而很少有人留意这个问题，通常是将微孔板一放入温箱即开始计时，这样就很简略构成实践测定中温育时间不行，弱阳性样本测不出来的问题。
（2）温育温度的挑选。在有的ELISA试剂盒的阐明书中，指出温育温度可有两种，例如，一种是37 ℃下1小时，另一种则为43 ℃下45分钟。从免疫测定的抗原抗体反应的实质来看，在较低的温度下反应较长的时间最为完全。如2～8 ℃下反应24小时。较高的反应温度，因为分子运动的加怜惜，反应时间缩短，这一点对分子含量较多的强阳性样本的测定没有问题，但对分子含量少的弱阳性样本则有漏检的或许。
（3）“边缘效应”的打扫。曾经在运用96孔板的ELISA测定中，常发现有“边缘效应”，即外周孔显色较中心孔深，发生这种“边缘效应”的原因或许为 96孔板周孔与中心孔外表或热力学特征的不同。但有研讨证实在温育中的热力学梯度或许是根本原因之所。聚苯乙烯本身为不良热导体，在实验室的惯例 ELISA测定中，将板从室温（通常在25 ℃左右）置于37 ℃温箱，板也升温时，在外周孔与中心孔之间或许存在一热力学梯度。因此运用水浴或在将反应溶液参加至板孔中时，将板和溶液均加热至温育温度（如37 ℃），就可以很简略地打扫“边缘效应”，而且可进步测定的重复性。
总而言之，在ELISA测定中，要保证好的测定效果，可选用上述简略方法来保证温育条件，即尽量选用水浴，温育中让微孔板浮于水面上，或将浸透水的沙布放入一大饭盒中成一湿盒，放于温箱中，这样就会因为板条孔底部直接与37 ℃水或湿布的接触，以及水浴箱或湿盒内的高温度，而使反应溶液的温度敏捷与温室平衡。
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