ELISA实验中应该注意的问题,包括样品稀释、试剂盒平衡、样品和试剂的混匀、加样、温育等问题。
1、样品稀释：
一般产品的样品稀释倍数均通过大量试验确定,以保证试验的灵敏度和特异性。酶联免疫反应是一种敏感性很高的反应,如果血清不稀释,不可避免会产生很强的非特异性反应,出现假阳性。
2、试剂盒平衡：
ELISA中所有试剂和板条均应在试验前平衡至室温(约25℃),一般需在室温放置20～30分钟以上。平衡时间太短会造成试剂混匀不够,样品孵育时间相对缩短,ELISA反应不够充分。冬季室温低,可将试剂盒置37℃温箱20分钟。
3、样品和试剂的混匀：
在稀释前、后的样品必须充分混匀,所有试剂在加样前也须摇匀,以保证试验的均一性。
4、加样：
加样是一项很重要的步骤。加样不可太快,要避免加在孔壁上部,不可溅出和产生气泡。加样太快,无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区,易导致非特异吸附。
5、温育：
温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个因素。ELISA作为一种固相免疫测定,抗原抗体的结合反应在固相上进行,要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合,必须在一定的温度条件下反应一定的时间。
6、洗板：
固相免疫测定技术是一种非均相免疫测定技术,需以洗涤操作将特异结合于固相的抗原或抗体与反应温育过程中吸附的非特异成份分离开来,以保证ELISA测定的特异性。洗液尽量不要溢出孔外；加洗液后要静置1分钟,甩去板孔中洗液后,一定要大力拍干；及时更换吸水纸,尤其是拍过酶标记物的吸水纸一定要弃去,否则可能影响试验结果。
7、显色：
显色一定要控制时间,根据试剂盒说明操作即可。一般来说,显色时间过短,结果偏低；显色时间过长,空白增高或者非特异性显色增加。
8、比色：
比色要注意波长的选择。以TMB为底物和以OPD为底物的试剂盒均有使用,而前者比色波长为450nm,后者为492nm,滤光片需根据要求随时更换。因此,容易出现滤光片错用的问题。
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